• 
• Aktuelle Ausgabe
• Methoden
• Labortricks
• Rankings
• Produktübersicht
• Buchbesprechungen
• Wissen pur
• Schöne Biologie
• Ansichten eines Profs
• Alle Editorials
• Archiv
• 
  
• Vorträge
• Kongresse
• Schulungen
• Jobs
• Bio-Links
• Bio-Landkarte
• 
  
• Die Lab-Files
• Laborkatastrophen
• Forscher Ernst
• 
  
• Redaktion
• LJ Mediadaten/Preise
• F+R Internet Agentur
• Impressum

Proteinmanufakturen
Produktübersicht: Expressionsklonierungs-Kits

Für eine erfolgreiche Expressionsklonierung sind zwei Dinge wichtig: eine clevere Screeningstrategie und ein möglichst effizientes Expressionsystem.

Nicht immer, wenn Molekularbiologen ihr Lieblings-Gen in einen Vektor klonieren und anschließend in ein Expressionsystem verfrachten, wollen sie das von der Synthesemaschinerie der Wirtszelle hergestellte rekombinante Protein isolieren und reinigen. Ein typisches Beispiel hierfür ist die Expressionsklonierung, die Wissenschaftler einsetzen, um Gene aufzuspüren und zu klonieren.

Die Grundidee der Expressionsklonierung ist einfach: Man kloniert eine cDNA Bibliothek in einen Expressionsvektor, verfrachtet diesen in eine passende Wirtszelle und durchmustert die exprimierte cDNA-Bank mit einer möglichst cleveren Screeningmethode. Hierzu setzen Forscher zum Beispiel monoklonale Antikörper ein oder koexprimieren ein Protein in den Wirtszellen das einzelne cDNA Klone, sprich deren Genprodukte, erkennt und in einer messbaren Reaktion mit ihnen wechselwirkt. Die herausgefischten cDNA Klone kann man dann sequenzieren und die von ihnen codierten Proteine weiter analysieren.


Aufwändiges Screening

Die cDNA-Bank herzustellen und in einem geeigneten Expressionsystem zu exprimieren ist mehr oder weniger Routine. Köpfchen und Phantasie sind jedoch bei der Screeningstrategie gefragt, die man sich zurechtbasteln muss, um an die gesuchten cDNA Klone heranzukommen. Es mag an diesen teilweise schwierig zu etablierenden und aufwändigen Screeningverfahren liegen, dass die Expressionsklonierung eher ein Nischendasein führt und der große Durchbruch nach ihrer Entwicklung in den späten achtziger Jahren ausblieb. In einigen Teildisziplinen der biomedizinischen Forschung ist sie aber durchaus verbreitet und nur schwer durch andere Methoden zu ersetzen.

So versuchen zum Beispiel Tumorimmunologen mit der Expresssionsklonierung Tumorantigene dingfest zu machen, die sich als Zielstrukturen für die Immuntherapie von Tumoren eignen könnten. Auch hier ist das zugrundeliegende Prinzip recht simpel: mit Hilfe der Expressionklonierung filtern die Forscher die bevorzugten Zielantigene zytotoxischer CD8+ -T-Lymphozyten (CTL) aus dem Blut von Tumorpatienten heraus. In der Praxis müssen sie dazu jedoch ziemlich tief in die Trickkiste der Immunbiologen greifen. Da zytotoxische T-Lymphozyten Protein-Antigene nur dann erkennen, wenn sie als kurzkettige Peptidschnipsel von HLA-Molekülen (Genprodukte des Haupthistokompatibilitätskomplexes) auf dem „Silbertablett“ präsentiert werden, muss das Expressionsystem sowohl HLA-Allele als auch Tumorantigene exprimieren.

Meist wählt man COS-7- oder HEK-293-Zellen als Wirtszellen und transfiziert diese zunächst mit einem Expressionsvektor, der eine aus den Tumorzellen des Patienten gewonnene cDNA-Bibliothek enthält. Damit hat man schon einmal die Tumorantigene in das Expressionssystem verfrachtet. Anschließend schleust man die ebenfalls in einem Expressionsplasmiden verpackten HLA-Allele des Patienten in die Wirtszelle. Jetzt fehlen nur noch die T-Lymphozyten, die Jagd auf die Tumorantigene machen sollen, die auf der Oberfläche der Zellen präsentiert werden, und ein Assay, der signalisiert, wenn sich eine T-Zelle ein Tumorantigen schnappt. Für Ersteres setzen die Forscher tumorreaktive T-Zellen ein, die sie aus mit Tumorzellen des Patienten stimulierten Blutlymphozyten gewinnen. Als Nachweis für Tumorantigen-bindende T-Zellen dient schließlich der so genannte ELISpot-Assay, der Antigen-spezifische T-Zellen anzeigt.

Der Knackpunkt bei der Expressionsklonierung ist eine möglichst effiziente Expression der cDNA in der Wirtszelle, im Idealfall sollte ein einzelner cDNA-Klon in den transfizierten Zellen für die Expression ausreichen. Diesem Idealzustand kommt ein auf Sindbis-Viren basierendes Expressionsystem sehr nahe, das eine Schweizer Gruppe um Martin Bachmann von der Cytos Biotechnology AG, Ende 2001 vorstellte (Koller et al. Nature 2001, Vol. 19, 851- 855).


Ein Viruspartikel reicht

Anstatt in einen üblichen Expressionsvektor, verpackt man die cDNA hier in replikationsfähige Viruspartikel. Deren Herstellung ist zwar recht kompliziert – die zwei dazu nötigen Plasmide muss man zunächst in vitro transkribieren, um mit den RNA-Strängen Zellen infizieren zu können, die die Viruspartikel produzieren – aber der Aufwand lohnt sich. Bereits ein einziges Viruspartikel, das eine cDNA aus der cDNA-Bibliothek beherbergt, genügt, um eine Säugerzelle, die als Wirt dient zu infizieren und dazu zu bringen, die cDNA zu exprimieren. Zudem lassen sich Virus-infizierte Zellen, die einen der gesuchten cDNA Klone exprimieren, per fluoreszenzaktivierter Durchflusszytometrie von den anderen Zellen abtrennen. Und noch ein Vorteil. Um die gewünschte cDNA klonieren zu können, muss man nicht mühsam die Zelle hochpäppeln, die die cDNA exprimiert. Die DNA lässt sich viel schneller direkt aus dem Viruspartikel selbst isolieren.

Wenn Sie sich an der Expressionsklonierung versuchen wollen und nach entsprechenden Systemen Ausschau halten, werden Sie schnell feststellen, dass nur sehr wenige speziell dafür entwickelte Kits auf dem Markt sind. Auf den nächsten Seiten finden Sie aber jede Menge genereller Expressionssysteme, die sich auch für die Expressionsklonierung eignen.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 06/2010, Stand: Juni 2010, alle Angaben ohne Gewähr)


Hier erhalten Sie diese Produktübersicht als Acrobat Datei (.pdf):

A4 Format zum Ausdrucken




Letzte Änderungen: 10.08.2010