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RNA-Kopiensammler
Produktübersicht: RNA-Isolierung

RNA ist für viele moderne Methoden unentbehrlich, angefangen bei der Real-Time-PCR über die Konstruktion von cDNA-Bibliotheken bis hin zu Microarrays. Kein Wunder, dass RNA-Extraktions Kits boomen.

Laut einer Umfrage des Scientific Advisory Boards (www.scienceboard.net) sind Life-Science-Forscher beim Thema RNA-Isolierung in zwei Lager gespalten: Eine Hälfte extrahiert die RNA mit der klassischen Phenol/Chlorofom/Guanidinium-Isothiocyanat-Methode (GTC-Methode), die andere setzt auf Reinigungskits, die auf kleinen Silica-Säulen basieren.

Viele kommerzielle GTC-Reagenzien, die so phantasievolle Namen tragen wie Trizol, RNAzol oder RNAwiz, sind nichts anderes als mit „geheimen“ Substanzen aufgepeppte Mischungen aus Phenol, Chloroform und Guanidinium-Isothiocyanat. Dass diese vorgefertigten Mixturen, wie auch selbstgemischte GTC-Lösungen, in jedem zweiten Labor anzutreffen sind, das RNA isoliert, verwundert nicht. Die GTC-Methode schont den Geldbeutel, ist narrensicher und funktioniert mit nahezu allen Organismen und Probenmaterialien.


Pipettiermarathon

Ganz ohne Schwächen ist die RNA-Extraktion mit GTC jedoch nicht. So muss man für sie etwa einen halben Tag Zeit einplanen und sich auf viele Pipettier-Schritte einstellen. Zudem sollte man eine ruhige Hand haben, damit man beim Abheben der oberen wäßrigen Phase, die die RNA enthält, nicht die Proteinklumpen und den Zellschrott mit pipettiert, die an der Phasengrenze, beziehungsweise in der unteren organischen Phase, herumschwimmen. Zu guter Letzt sind Chloroform und Phenol nicht gerade die Lieblings-Substanzen des Molekularbiologen, und selbst wenn man mit ihnen konsequent im Abzug arbeitet, ist ein abendlicher Chloroform-Brummschädel nicht ausgeschlossen.


Schnell und ohne Risiko

Völlig ohne Chloroform und Phenol kommen die Kits mit den kleinen Säulen aus, die die zweite Hälfte der RNA-Isolierer favorisiert. Bei diesen bleibt die RNA in Gegenwart von strukturzerstörenden (chaotropen) Salzen wie Guanidinium-Isothiocyanat an der Säulen-Oberfläche aus Silica oder einem anderen adsorbtiven Material hängen. Nach wenigen Wasch- und Zentrifugations-Schritten spült man die RNA mit einem entsprechenden Elutionspuffer von der Säule und fällt sie schließlich mit der üblichen Melange aus Isopropanol und Kalium- oder Natriumacetat. Diese Technik ist zwar teurer als die GTC-Methode, dafür sind in den Säulen-Protokollen keine giftigen Substanzen vorgesehen und die RNA-Extraktion dauert selten länger als eine Stunde.

Dass dennoch viele RNA-Isolierer der GTC-Methode die Treue halten, könnte daran liegen, dass die RNA-Ausbeute bei den Säulen nicht immer berauschend ist. Diese Erfahrung machte zumindest der Laborjournal-Redakteur, als er in seiner Zeit als Doktorand mit einem säulenbasierten Kit RNA aus Bäckerhefen isolierte. Eigentlich brauchte er den Kit nicht – die GTC-Methode lieferte ihm routinemäßig pfundweise RNA – aber weil er zu zwei hartnäckigen Vertrieblern nicht unhöflich sein wollte, versprach er einen ihrer RNA-Testkits auszuprobieren. Um es kurz zu machen: Bei der GTC-Methode machte sich nach der Alkoholfällung regelmäßig ein fettes RNA-Pellet in der Spitze des Reaktiongefäßes breit. Die mit dem Kit isolierte RNA-Menge hingegen war so winzig, dass man schon zweimal hinschauen musste, um überhaupt etwas zu erkennen.

Diese Beobachtung kann natürlich ein Einzelfall gewesen sein. Zu einem ähnlichen Ergebnis kam aber kürzlich auch eine indisch-deutsche Gruppe um Heinz Fehrenbach vom Leibniz-Zentrum für Medizin und Biowissenschaften in Borstel, die untersuchte, welche der beiden Extraktions-Methoden besser geeignet ist, um RNA aus Lungengewebe zu isolieren (Muyal et al., Diagnostic Pathology 2009, 4:9, 1-8). Auch diese Forscher erhielten mit dem Säulen-basierten Kit (vom gleichen Hersteller stammte auch der entsprechende Hefe-Kit, den der LJ-Redakteur benutzte) signifikant kleinere Ausbeuten als mit der GTC-Methode, bei vergleichbarer Reinheit der isolierten Lungen-RNA. Die Gruppe vermutet, dass sich die Silicagel-Membran in den Säulen mit Gewebelysat zusetzt und sie dadurch weniger RNA adsorbieren kann.


Selektive Bindung

Der Kit überzeugte Fehrenbachs Gruppe aber in einem anderen entscheidenden Punkt: die mit den Säulen isolierte RNA enthielt weit mehr intakte lange RNA-Fragmente als die mit der GTC-Methode isolierte. Weil die Forscher bei kurzen Fragmenten keinen Unterschied feststellten, gehen sie davon aus, dass die Silica-Membran selektiv lange RNA-Bruchstücke bindet. Zudem können, so die Borstler Gruppe, Chloroform- und Phenolreste in der mit der GTC-Methode isolierten RNA nachfolgende Prozesse stören, etwa die Reverse Transkription der RNA bei der quantitativen PCR.

Nicht nur die Anhänger von Säulen-basierten Kits und GTC-Methode halten sich also offenbar die Waage, sondern auch die Vor- und Nachteile der zwei RNA-Extraktions-Techniken. Unzählige Kits und RNA-Extraktionslösungen, mit denen Sie einer der beiden Methoden (oder beiden gleichzeitig) frönen können, finden Sie auf den nächsten Seiten.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 05/2010, Stand: Mai 2010, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 05.06.2010