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Kügelchen für Zelltests
Produktübersicht: Partikel-basierte Zellassays

Bunte Plastikperlen sind als Rohmaterial für die Schmuckherstellung beliebt. In jüngster Zeit finden auch immer mehr Biowissenschaftler Gefallen an farbigen Mikro-Perlen.

Bis vor wenigen Jahren waren ELISAs (Enzyme-linked Immunosorbent Assays) und Western Blots die unangefochtenen Platzhirsche im Labor, wenn es darum ging Proteinmengen zu bestimmen, die Größe von Proteinen festzulegen oder mögliche posttranslationale Modifikationen zu detektieren. Inzwischen bahnt sich ein Ende dieser Vormachtstellung an, denn mit Partikel-basierten Assays haben ELISA und Western Blot ernsthafte Konkurrenz bekommen.

Partikel- oder Bead (Perlen)-basierte Assays funktionieren ganz ähnlich wie ELISAs­ und unterscheiden sich im Grunde nur durch die Form der Oberfläche an die der Primärantikörper gekoppelt ist. Bei ELISAs immobilisiert man die Primärantikörper, die zum Beispiel einen Analyten aus einer Proteinlösung herausfischen sollen, auf der ebenen Oberfläche eines Mikrotiterwells.

Bei Partikel-basierten Assays platziert man sie dagegen auf der runden Oberfläche winziger Plastikperlen mit nur wenigen Mikrometern Durchmesser. Das hat zum einen den Vorteil, dass bei Bead-Assays bereits wenige Mikroliter als Testvolumen ausreichen, weil das Verhältnis zwischen Oberfläche und Volumen bei den Kügelchen sehr groß ist. Zum anderen verhalten sich die als Suspension gelösten Miniperlen bei kinetischen Messungen wie Flüssigkeiten.

Weit interessanter ist jedoch die Möglichkeit, einzelne Beads beziehungsweise Teilpopulationen von Beads (Bead-Klassen) kennzeichnen zu können, um unterschiedliche Substanzen gleichzeitig zu analysieren (Multiplex-Analyse). Bereits Mitte der siebziger Jahre entwickelten Wissenschaftler ein Verfahren, mit dem sie verschieden große Mikropartikel, die als Plattform für Antigene dienten, in einem Durchflusszytometer anhand der Lichtstreuung sortieren konnten. Der entgültige Durchbruch gelang der Partikel-basierten Multiplex-Analyse, als Ende der neunziger Jahre ein schlauer Kopf auf die Idee kam, die Beads mit zwei fluoreszierenden Farbstoffen (Rot und Infrarot) mit jeweils zehn abgestuften Farbintensitäten zu markieren. Aus dieser Farbcodierung resultieren zehn mal zehn, also 100 verschiedene Bead-Klassen, die der Laserstrahl eines Durchflusszytometers problemlos auseinander halten kann. Theoretisch kann man mit den fluoreszenzcodierten Beads 100 Substanzen gleichzeitig analysieren, sofern man sie mit den entsprechenden Antikörpern oder Liganden bestückt. In der Regel reichen aber deutlich kleinere Substanzpools für die meisten Anwendungen aus.


Zytokin-Sandwich

Einer der Renner unter den kommerziellen Partikel-basierten Zellassays sind Zytokin-Multiplex-Assays, mit denen sich auf einen Schlag beinahe alle Zytokine erfassen lassen, die in Menschen-, Ratten- oder Mäusezellen während der Immunantwort umherschwirren. Zytokin-Assays sind wie die meisten Partikel-basierten Immunoassays als Sandwich-Assays konzipiert, deren Prinzip ELISA-Anwender schon seit Jahrzehnten kennen und einsetzen. Bei einem Sandwich-Assay koppelt man zunächst einen Primärantikörper an die Oberfläche der meist aus Polystyrol bestehenden Beads. Der Primärantikörper schnappt sich während des Assays das passende Antigen und präsentiert dieses einem fluo­reszenzmarkierten Zweitantikörper, der ebenfalls an das Antigen bindet. Letzteres wird auf diese Weise zwischen Erst- und Zweitantikörper eingequetscht, wie die Salami zwischen den zwei Brotscheiben eines Sandwiches. Auf ihrem Weg durch ein nachgeschaltetes Durchflusszytometer passieren die Miniperlen schließlich zwei Laserstrahlen: einen roten, der den Farbton des vorbeifliegenden Beads erkennt, sowie einen grünen der den fluoreszenzmarkierten Zweitantikörper registriert. Mit dieser eleganten Technik lassen sich die einzelnen Bead-Klassen und die von ihnen eingefangenen Zytokine eindeutig zuordnen und quantifizieren.

Man kann den Spieß aber auch umdrehen und ein Antigen statt des Antikörpers an die Beads koppeln, um zum Beispiel in Blut oder Plasma Jagd auf Antikörper zu machen, die als Reaktion auf eine Entzündung entstehen. Auch Rezeptorforscher haben inzwischen Bead-basierte Assays für sich entdeckt und nutzen diese, um Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Liganden zu untersuchen. Dazu heften sie zum Beispiel G-Protein-gekoppelte Rezeptoren an die Minikügelchen und messen dann mittels Bead-Assay die Interaktionen der Rezeptoren mit Liganden und Regulatoren.

Bead-Assays mit 100 gleichzeitig analysierbaren Substanzen sind aber noch längst nicht das Ende der Multiplexing-Fahnenstange. Mit Barcode-markierten Aluminiumstäbchen im Nanoformat lassen sich mittlerweile tausende Substanzen gleichzeitig detektieren und analysieren. Die mit einem fünfstelligen Strichcode versehenen Nanostäbchen haben laut Hersteller noch weitere Vorteile gegen­über Beads. So erkennt das für die Detektion der Alustäbchen eingesetzte Fluoreszenzlesegerät die einzelnen Barcodes mit nahezu hundertprozentiger Präzision. Hinzu kommt, dass der Strichcode nicht ausbleichen kann, wie die Farbcodierung bei Beads, und die Nanostäbchchen auch bei harten Bedingungen funktionieren, etwa bei extremen Temperaturen oder pH-Werten.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 04/2010, Stand: März 2010, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 26.04.2010