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Ausdruckssache
Produktübersicht: Expressionsvektoren

Ohne Expressionsvektoren wären Molekularbiologen aufgeschmissen. Fast jeder ist auf die kleinen Helfer angewiesen.

Als Herbert Boyer Anfang der 70er Jahre an den ersten rekombinanten Plasmiden werkelte, war ihm wohl schnell klar, dass er an einem brandheißen Thema arbeitete, das ihm sowohl wissenschaftlichen als auch finanziellen Erfolg bescheren könnte. Aber selbst der äußerst geschäftstüchtige Boyer, der 1977 den Biotech-Riesen Genentech mitgründete, hätte wohl nie damit gerechnet, dass Expressionsvektoren 30 Jahre später eine solch zentrale Rolle in der Molekularbiologie und Biotechnologie spielen würden. Kaum ein Labor, in dem nicht ein selbstgestrickter oder kommerzieller Expressionsvektor in der Gefriertruhe darauf wartet, in einen Wirt geschleust zu werden um das Lieblingsprotein der jeweiligen Arbeitsgruppe zu exprimieren.

Inzwischen haben Molekularbiologen viele unterschiedliche Expressionssysteme und die dazu passenden Vektoren entwickelt. Dennoch dürften Expressionsvektoren für die Synthese rekombinanter Proteine in E. coli-Zellen noch immer am zahlreichsten in den Laboren vertreten sein. E. coli-Zellen können zwar keine posttranslationalen Modifikationen in die synthetisierten Proteine einführen, produzieren auch schon mal fehlgefaltete oder verklumpte Proteine und haben noch ein paar andere kleine Macken. Dafür sind sie als Expressionssystem unschlagbar schnell, einfach in der Handhabung und kostengünstig.


Tags, Marker und Promotoren

Hinzu kommt, dass es Hunderte verschiedener Expressionsvektoren für E. coli gibt, die mit unterschiedlichen Promotoren, Selektionsmarkern oder Fusionspartnern (Tags) ausgestattet sind. Zu den gebräuchlichsten Promotoren zählen verschiedene IPTG-induzierbare Varianten des lac-Promoters, T7 Promotoren, trp- und phoA-Proteine, die durch Tryptophan- beziehungsweise Phosphatmangel induziert werden, sowie araB-Promotoren, die durch Arabinose auf Touren kommen.

Viele Molekularbiologen exprimieren ihre Proteine in E. coli inzwischen mit dem pET-Vektorsystem, das sich der T7-RNA Polymerase-Spezialist F. William Studier bereits Ende der 80iger Jahre ausgedacht hat. pET Expressionsvektoren enthalten einen Promoter aus dem Bakteriophagen T7, an den die T7-RNA-Polymerase sehr spezifisch bindet. Die basale Expression stromabwärts klonierter Gene ist deshalb in E. coli-Zellen, die keine T7-RNA-Polymerase enthalten, verschwindend gering.

Um sie anzukurbeln, muss man die E. coli-Zellen dazu bringen auch die T7-RNA-Polymerase zu synthetisieren. Dazu bieten sich zwei Methoden an. Entweder man integriert das T7-RNA-Polymerase-Gen inklusive eines vorgeschalteten lac-Promoters in das E. coli-Chromosom und induziert die Genexpression mit IPTG, oder man infiziert die Zellen mit dem Bacterio-phagen l CE6, der die T7-Polymerase exprimiert. Das Endergebnis ist in beiden Fällen gleich: Die E. coli-Zellen transkribieren fast ausschließlich das in den pET-Vektor klonierte Gen und produzieren praktisch nur noch das von diesem Gen kodierte Protein.

Wenn das Wunschprotein immer nur als funktionsloser Klumpen aus E. coli herauskommt oder glykosyliert, phosphoryliert, acetyliert oder auf andere Art modifiziert sein soll, wird es Zeit sich von E. coli als Expressionssystem zu verabschieden. Es muss ja nicht gleich ein Säugersystem sein, bei dem allein die Kultur der Zellen jede Menge Zeit und Nerven kostet. In vielen Fällen reicht auch ein Hefeexpressionssystem aus. Die meisten denken dabei sofort an die Bäckerhefe, aber auch hier haben clevere Molekularbiologen Alternativen entwickelt.

Neben Klyveromyces lactis macht derzeit insbesondere die Hefe Pichia pastoris Karriere als Produzent rekombinanter Proteine. Im Gegensatz zu Saccharomyces cerevisiae, die Zucker über alles liebt, bevorzugt Pichia pastoris Methanol. Diesen oxidiert die Alkoholoxidase I (AOXI) zunächst zu Formaldehyd. Die Affinität von AOXI zu Sauerstoff ist aber ziemlich mau. Pichia pastoris gleicht dieses Manko aus, indem sie große Mengen an AOXI produziert. Dazu hat sie einen extrem starken, durch Methanol induzierbaren Promoter ausgebildet. Dieser sorgt dafür, dass AOXI auf einen Anteil von bis zu 30 Prozent an der Gesamtproteinmenge anschwillt, wenn Pichia pastoris mit Methanol gefüttert wird.


Gasgeben mit Methanol

Den starken AOXI Promoter haben die Entwickler von Expressionsvektoren inzwischen in ihre Konstrukte eingebaut. Wer sein Lieblingsgen damit exprimieren will, muss es in einen AOXI-Vektor klonieren, diesen in Picha pastoris-Zellen einschleusen und dann mit Methanol - das auch Geschwindigkeitsfreaks als Brennstoff für turbogeladene Dragstermotoren mit mehreren tausend PS verwenden - Gas geben.

Zurück zu Herbert Boyer. Dessen Gruppe exprimierte bereits 1973 ribosomale Frosch-RNA in E. coli-Zellen. Heute sind Expressionsvektoren, die nichtkodierende RNAs zum Beispiel siRNAs, mi-RNAs oder shRNAs exprimieren, aktueller denn je. Mit ihnen lassen sich die kurzen RNA-Schnipsel, die die RNA-Interferenz ins Rollen bringen, direkt in den Zielzellen exprimieren. Das hat einige Vorteile gegenüber Methoden die synthetische siRNAs verwenden. So bleibt zum Beispiel der Gen-Knockdown über einen längeren Zeitraum stabil und lässt sich mit einem induzierbaren Promoter regulieren. Darüber hinaus kann man mit diesen Vektoren RNA-Interferenz-Experimente auch in schwer zu transfizierenden Zellen durchführen.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 12/2008, Stand: November 2008, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 29.12.2008