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Blaupause fürs Protein
Produktübersicht: Western Blotting

Trocken oder nass? Diese Frage stellt sich nicht nur beim Friseur, wenn es der Haarpracht an den Kragen geht oder ein neuer Schnitt fällig ist, sondern auch beim Western Blot.

Während die einen - vor allem Hersteller von Tank-Blottern - auf die Vorzüge nasser Blotverfahren schwören, lassen die anderen nichts über trockene Blotting-Techniken kommen. Ganz ohne Anoden- und Kathodenpuffer kommen letztere aber meist nicht aus. Zwar muss man bei den sehr häufig eingesetzten Semi-Dry-Blottern den Puffer nicht literweise einfüllen wie bei Tank-Blottern. Ohne puffergetränktes Blottpapier auf der Ober- und Unterseite des "Blotsandwiches" fließt jedoch auch bei Semi-Dry Blotapparaturen kein Strom. Wissen Sie eigentlich wer den seltsamen Begriff "Semi-Dry" eingeführt hat? Entweder etwas ist trocken oder nass - aber halbtrocken? So bezeichnet man allenfalls süßlich schmeckende Weine um die Weinliebhaber meist einen großen Bogen machen.


Trockener Western Blot

Inzwischen muss aber niemand mehr auf trocken ausgebauten Wein und wirklich trockene Blotverfahren verzichten. Seit knapp zwei Jahren ist ein Trockenblot-Gerät auf dem Markt, das Ihnen die Panscherei mit Blotpuffer und Methanol komplett erspart. Die für den Stromfluss nötigen Ionen sind bei diesem nicht in einem Puffer gelöst, sondern in eine Gelmatrix eingebunden. Letztere muss man jedoch nach jedem Blot austauschen und durch eine neue ersetzen. Kostenpunkt etwa zehn bis 15 Euro, je nach Größe und Blotmembran (Nitrozellulose oder PVDF). Ansonsten funktioniert der Dry-Blotter wie die gängigen halbtrockenen Varianten: Deckel auf, PAGE-Gel und Blotmembran wie ein Sandwich zwischen Anode und Kathode packen, Deckel wieder zu und Schalter umlegen. Die Zeit, die die Proteine benötigen um entlang des elektrischen Feldes vom PAGE-Gel auf die Blotmembran zu wandern ist jedoch noch kürzer als bei vielen Semi-Dry Blottern. Gerade einmal sieben Minuten dauert der Proteintransfer im Dry-Blotter. Bei Semi-Dry- Blottern sollte man dafür im Schnitt zehn Minuten bis eine Stunde einkalkulieren und Tank-Blots können auch schon mal über Nacht laufen. Die durchschnittliche Blot-Zeit liegt bei letzteren zwischen einer halben und zwei Stunden.


Langsam und gut gekühlt

Die längere Dauer von Tank-Blots hat auch Vorteile. Wer mit temperaturempfindlichen, nativen Proteinen arbeitet, wird diese lieber langsam und schonend in einer gut gekühlten Tank-Blot-Apparatur auf die Blotmembran übertragen. Das ist allemal besser, als sie mit voll aufgedrehter Spannung in zehn Minuten durch das elektrische Feld eines Semi-Dry-Blotters zu zerren und sie dabei zu verbruzzeln. Auch bei großen Proteinen und solchen, die sich vehement gegen den Transfer vom Gel auf die Blotmembran wehren, ist ein Tank-Blotter keine schlechte Wahl. In einige Tanks können Sie fünf Gele auf einmal hineinstellen und gleichzeitig blotten. Bei Semi-Dry-Blottern ist in der Regel bei drei parallelen Blots Schluss.

Wie bei den in der Produktübersicht in Laborjournal 4/2007 vorgestellten Elektrophorese-Kammern fällt auch bei Tank-Blottern der Trend zu einem, im Vergleich zu früheren Modellen, geradezu peppigen Design auf. Blotter-Deckel in grün, der Farbe der Hoffnung (auf einen guten Blot), das hat doch was. Egal ob nass oder trocken geblottet, interessant ist letztendlich nur, was auf der Blotmembran angekommt. Um sich darüber einen Überblick zu verschaffen, färbt man die geblotteten Proteine meist kurz an. Eine der günstigsten und schnellsten Färbemethoden ist nach wie vor die Protein-Färbung mit einem anionischen Farbstoff wie Amidoschwarz oder Ponceaurot, die schon der Urvater des Western Blots, Harry Towbin, vor 30 Jahren einsetzte. Wer's empfindlicher haben möchte, kann auf neuere Techniken, etwa die Färbung mit kolloidalem Gold oder fluoreszierenden Proteinfärbern wie SYPRO-Rot oder -Orange zurückgreifen.

Auch am Prinzip der Immundetektion einzelner Proteine hat sich seit den Anfängen des Western Blots nur wenig verändert. Noch immer verlassen sich die meisten Biologen auf die bewährte Kombination aus spezifischem Primärantikörper und Enzym-konjugiertem Sekundärantikörper. Auch bei letzteren gibt es wenig neues. In der Regel katalysiert die Merretichperoxidase (HRP) oder die alkalische Phosphatase (AP) eine messbare Farb-, Fluoreszenz- oder Lumineszenzreaktion. Um so mehr hat sich bei den Substraten für HRP und AP getan sowie bei Verstärkern (Enhancern), die die Empfindlichkeit der Immundetektion erhöhen. Mittlerweile lassen sich mit einigen Detektionskits geradezu homöopathische Protein-Mengen nachweisen. Der Empfindlichkeitsrekord liegt derzeit bei einem Yoctomol. Yocto ist kein abstruser Begriff aus der Homöopathie, sondern der SI-Präfix für den Faktor 10-24. Ein Yoctomol entspricht 0,6 Molekülen. Das sollte genügen, um mit einem Western Blot auch noch das am Schwächsten exprimierte Protein einer Zelle aufzuspüren.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 6/2008, Stand: Mai 2008, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 26.07.2008