Kaum ein biowissenschaftliches Labor kommt ohne Chromatographie-System für die Reinigung oder Analyse von Proteinen aus. Während es bei der präparativen Flüssigchromatographie noch recht gemütlich zugeht, werden die Substanzen bei der analytischen HPLC mit hohem Druck durch immer dünnere Säulen gepresst, um eine möglichst rasche und effektive Trennung zu erzielen. Foto: Ohio State University
In den Anfangszeiten der Flüssigchromatographie wurde hektoliterweise Laufmittel auf meterlange Säulen gekippt. In modernen, superdünnen Nano-HPLC-Säulen fließt inzwischen so wenig Lösungsmittel, dass es nicht einmal mehr für einen winzigen Flüssigkeitstropfen reicht.
Die Flüssigchromatographie (LC) ist eine der ältesten Analysemethoden in der Biologie. Schon zu Beginn des 20. Jahrhunderts versuchten Forscher, biologische Proben mit ihr zu trennen und die darin enthaltenen Bestandteile beziehungsweise Analyten zu analysieren oder zu präparieren. Dazu stopften sie zumeist Kieselgel, das als stationäre Phase mit den Analyten wechselwirken sollte, in eine lange Glassäule mit Glasfritte und Auslaufhahn. Die zu trennende Probe lösten sie in einem geeigneten Laufmittel (Eluent) und trugen dieses auf das Säulenmaterial auf. Anschließend warteten sie, bis die Flüssigkeit, angetrieben durch die Schwerkraft, aus der Säule herauströpfelte, fingen das Eluat in kleinen Gläschen auf und analysierten den Inhalt.
Bereits in den vierziger Jahren wussten die zwei Vordenker der Flüssigchromatographie, Archer Martin und Richard Synge, die 1952 für die Erfindung der Partition-Chromatographie den Chemie-Nobelpreis erhielten, was man theoretisch tun muss, um eine möglichst effektive Trennung zu erreichen: Sehr kleine Partikel in die stationäre Phase packen, und das Laufmittel gleichzeitig mit hohem Druck durch die Säule pressen.
Zu Zeiten von Martin und Synge war die technische Umsetzung dieser theoretischen Vorgaben aber noch Utopie. Erst Mitte der sechziger Jahre entwickelte der englische Chemiker Elmar Piel ein Hochdruck-Flüssigkeitchromatographie (HPLC)-Verfahren, mit dem er Farbstoff-Mischungen sowie einen Spinat-Extrakt auftrennte und analysierte. Als stationäre Phase packte Piel Silica-Granulat mit Partikelgrößen von kaum einem Mikrometer Durchmesser in kleine Glaskapillaren mit ein oder zwei Millimetern Innendurchmesser. Das Laufmittel presste er mit einer Hochdruckpumpe, die mehr als 200 bar erzeugte, durch die Glassäulchen, die ihm dabei erstaunlicherweise nicht um die Ohren flogen. Piels HPLC dauerte nur wenige Minuten und trennte die Substanzen mit hoher Auflösung.
Das HPLC-Verfahren des Engländers verschwand jedoch sang- und klanglos in der Versenkung. Neuen Schwung in die Sache brachte der ungarische LC-Pionier Csaba Horváth, der kurz nach Piel die ersten Ionenaustausch-Säulen für die Nukleinsäure-Analyse vorstellte. Und nachdem der Amerikaner Sandy Lipsky nur wenig später die erste HPLC-Apparatur mit angeschlossenem UV-Detektor entwickelt hatte, erkannten auch die Hersteller instrumenteller Analysegeräte das Potential der HPLC. Inzwischen zählen HPLC-Instrumente zu den in den Biowissenschaften am häufigsten eingesetzten Chromatographie-Systemen.
Die Ingenieure in den Entwicklungsabteilungen der großen HPLC-Hersteller kannten natürlich die Forderung von Martin und Synge nach möglichst kleinen Säulenpartikeln. Partikel mit Durchmessern unter zwei Mikrometer (Sub-2µ), statt der üblichen zwei bis fünf Mikrometer in üblichen HPLC-Säulen, erzeugen jedoch extreme Rückdrücke bis über 1.000 bar – viel zu hoch für klassische HPLC-Instrumente, die mit etwa 400 bar arbeiten. Erst zu Beginn des neuen Millenniums knackten die Konstrukteure auch diese Nuss. Seither haben viele Anbieter ultraHPLC oder kurz uHPLC-Geräte im Portfolio, die mit hohen Drücken zurechtkommen.
Die uHPLC mit Sub-2µ-Partikeln ist nicht nur schneller und empfindlicher als die klassische HPLC. Sie führt auch zu schärfer getrennten Signalen (Peaks) und einer besseren Auflösung. Zudem spart sie Laufmittel und damit Geld. Eigentlich perfekte Vorraussetzungen für viele Forschungslabore, wäre nicht der erheblich höhere Preis der Geräte – und die Scheu vieler Wissenschaftler, die noch einwandfrei funktionierenden HPLC-Anlagen einfach verstauben zu lassen.
Es gibt aber noch einen weiteren Trick, die HPLC zu optimieren: Reduziert man sowohl den Innendurchmesser der Säule als auch die Flussrate des Laufmittels, wird aus der HPLC eine sehr sensitive Nano-HPLC. Statt der üblichen HPLC-Säulen mit 4.6 Millimeter Innendurchmesser (ID), werden bei der Nano-HPLC Säulen mit weniger als 100 Mikrometer ID eingebaut. Gleichzeitig verringert man die Flussraten von einigen dutzend Mikrolitern auf wenige hundert Nanoliter pro Minute. Tatsächlich fließt durch Nano-HPLC-Säulen so wenig Laufmittel, dass man am Säulenende nicht einmal mehr einen Tropfen sehen würde, könnte man in die Säule hineinschauen.
Der Grund für die hieraus resultierende erhöhte Sensitivität ist ziemlich einleuchtend: Die Analyten sind in dem winzigen Volumen des Laufmittels stärker konzentriert als bei der klassischen HPLC. Ergo gelangen auch mehr zur Detektionseinheit – die bei der in der Proteomik üblichen LC-MS aus einem Massenspektrometer besteht.
Ganz so einfach, wie auf dem Papier sind die Konstruktion und der Betrieb von Nano-HPLC-Anlagen natürlich nicht. Im Grunde müssen sämtliche Komponenten verkleinert werden, zum Beispiel Pumpen, Ventile, Verbindungstücke, Injektionsschleifen oder Detektoren. Durch die geringen Volumina treten ganz neue Probleme auf. So führen die kleinen Flussraten, etwa bei Gradienten-Läufen, zu trägeren Reaktionszeiten (Delay Time), weil mehr Zeit vergeht, bis die veränderte Laufmittelzusammensetzung in der Säule tatsächlich ankommt und das Trennverhalten beeinflusst.
Trotz dieser Umstellungsschwierigkeiten ist die Nano-HPLC inzwischen nicht nur etwas für Spezialisten, sondern auch für „normale“ Anwender – zumal etliche Hersteller entsprechende kommerzielle Systeme anbieten.
Für Biologen immer interessanter wird die lange Zeit nur von experimentierfreudigen HPLC-Freaks durchgeführte Zweidimensionale HPLC (2D-HPLC). Bei dieser trennt man die Substanzgemische nacheinander mit zwei unterschiedlichen Säulen. Die beiden Säulen hierzu einfach nur in Serie zu schalten, und das Eluat von der ersten direkt auf die zweite zu leiten, würde jedoch nicht viel bringen. Der Trick der 2D-HPLC besteht darin, einzelne Fraktionen der ersten Säule mit schlecht aufgelösten Peaks herauszupicken und nacheinander durch die zweite Säule zu schicken.
Bei dieser Vorgehensweise sind zwei Extreme denkbar: Der Experimentator greift nur eine einzige Fraktion heraus und leitet sie auf die zweite Säule. Oder er sammelt kontinuierlich diskrete Fraktionen in regelmäßigen Zeitintervallen von wenigen Sekunden und trägt diese eine nach der anderen auf die zweite Säule auf. Die erste Technik wird als Single Haircut-Methode bezeichnet (LC-LC), die zweite nennt sich umfassende 2D-LC (LC x LC).
Der Effekt ist jeweils gleich: Die Trennleistung des Gesamtsystems ist um ein Vielfaches höher als die der einzelnen Säulen, weil die Peak-Kapazitäten der Säulen miteinander multipliziert werden. Die Peak-Kapazität ist ein Maß für die Anzahl der Peaks, die eine Säule in einer bestimmten Zeit sauber auflösen kann. Je höher sie ist, desto wildere Substanz-Mischungen lassen sich mit der jeweiligen Säule beziehungsweise HPLC-Methode trennen. Kein Wunder, dass die Technik insbesondere bei Proteomikern immer beliebter wird. Meist nutzen sie die LC x LC, um sehr komplexe Proteinmischungen bei der LC-MS auseinander zu fieseln, bevor sie im Massenspektrometer analysiert werden.
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 11/2017, Stand: Oktober 2017, alle Angaben ohne Gewähr)
