Die Banden eines Gels oder Blots sollten sich möglichst scharf und präzise vom Hintergrund abheben. Ein wirklich überzeugendes Bild eines Western Blots oder Agarose-Gels zu erstellen, ohne die Grenze des Erlaubten zu überschreiten, ist aber eine Kunst für sich. Kaum ein Gel oder Blot kommt ohne Bildbearbeitung aus, die aus den tatsächlich vorliegenden Signalen das bestmögliche Bild herausholen soll. Eigentlich sind es immer dieselben Handgriffe: Bild zurechtrücken und ausschneiden, Hintergrund abgleichen und Kontrast optimieren, Banden zur Quantifizierung des Signals einrahmen und danach die Bahnen beschriften.
Die meisten Forschenden verwenden für die einzelnen Schritte der Bildanalyse verschiedene Software-Tools oder nutzen dazu standardisierte Programmpakete. Kenneth Campbells Gruppe an der Universität von Kentucky in Lexington, USA, war mit den üblichen Standardlösungen für die Gel-Analyse aber nicht zufrieden. Die Forschenden stellten daher ein eigenes Tool namens GelBox auf die Beine, das nicht nur die typischen Arbeitsabläufe des Teams bei Gelen und Blots in einem Programmpaket integriert – es ist auch so konzipiert, dass sich die einzelnen Schritte der Bildbearbeitung rückverfolgen lassen.
Dokumentierte Details
Das Team programmierte GelBox mit der Programmiersprache MATLAB, die in der Regel für Studierende und Mitarbeitende von denjenigen Universitäten frei ist, die Lizenzverträge mit dem Anbieter von MATLAB (MathWorks) abgeschlossen haben.
GelBox übernimmt die Analyse der Gel- oder Blotbilder vom Rohformat bis zur fertig beschrifteten Abbildung. Da das Programm jedes Detail der Bildauswertung dokumentiert und die konkrete Abfolge der Befehle hinterlegt, ist die Analyse transparent und reproduzierbar. Fragen wie: „Hat die Antikörper-Charge vom letzten Jahr wirklich bessere Blots geliefert oder wurde damals der Hintergrund im Nachhinein geschickter bereinigt?“, sind damit schnell beantwortet. Die Befehlsdokumentation wird zusammen mit Daten von Roh- und Fertigbild, Beschriftung, berechneten Signalstärken, Dichteprofilen et cetera in einer eigenen GelBox-Datei (GBX) hinterlegt. GBX-Dateien sind im MAT-Format geschriebene, komprimierte Dateien. Das Programm kann bereits abgespeicherte Dateien laden und erleichtert deren weitere Bearbeitung, etwa durch Umbenennung. Labore, die sich auf GBX einigen, können ihre Bilder und Bandenintensitäten untereinander einfacher vergleichen.
Verschiedene Korrekturoptionen
GelBox akzeptiert Ursprungsdateien mit den Bildformaten PNG, TIFF, BMP, GIF, JPEG, JPEG 2000, PBM sowie PGM. Die Datei kann per Dropdown geladen werden und erscheint auf der Nutzeroberfläche in einem eigenen Fenster. Ein zweites Fenster direkt daneben ist für Auswertungen einzelner Banden beziehungsweise Bandenintensitäten reserviert. Dort erscheinen Bandenausschnitte, Dichteprofile sowie tabellarisch aufgeführte Signalstärken. Regionen von Interesse, die eine bestimmte Bande und umliegenden Hintergrund enthalten, lassen sich einrahmen, um sie mit dem Hintergrund abzugleichen. Der Algorithmus berücksichtigt, dass der Hintergrund meist nicht über das gesamte Gel hinweg konstant ist, sondern über größere Regionen dunkler oder heller erscheint. Das Programm erkennt den Trend und bietet für die Korrektur die Optionen Spline, Linear und Rolling Ball an. Was genau hinter diesen Korrekturmöglichkeiten steckt, erklärt die Gruppe im Methodenteil ihres Manuskripts (LINK unten).
Für Anwendende ist aber entscheidender, dass die drei Varianten Dichteprofile des ausgewählten Blot-Areals zur Wahl stellen und die Rolling-Ball-Variante meist die besten Ergebnisse liefert. Zur Optimierung der Korrektur-Algorithmen generierte das Team am Computer Dutzende Gel-Bilder mit bekannter Signalstärke jedes einzelnen Pixels und analysierte sie mit dem GelBox-Tool.
Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung sowie ein detailliertes Troubleshooting mit Beispielbildern und Videos für GelBox stellt das Team auf GitHub zur Verfügung. Von dort ist auch das GBX-Installationsprogramm abrufbar, ebenso wie die Installation von MATLAB.
Andrea Pitzschke
Gulbulak U. et al. (2024): GelBox: Open-source software to improve rigor and reproducibility when analyzing gels and immunoblots. BioRxiv, DOI: 10.1101/2024.03.07.583941.
Bild: Pixabay/PublicDomainPictures