Pflanzen-DNA zerfällt etwa sechsmal schneller als DNA aus tierischen Proben. Wer nicht an alten Knochen, sondern an getrockneten Kräutern forscht, muss sich also sputen. Und er muss bescheiden sein und sich oft genug mit dem Hauch eines Blatts zufrieden geben. Viel Spielraum für die Optimierung von DNA-Extraktionsprotokollen, -Bibliotheken und -Sequenzierung bleibt also nicht.
DNA, an der der Zahn der Zeit genagt hat, liegt stark zerstückelt vor. Sogenannte ancient DNA (aDNA) besteht aus mickrigen Fragmenten, die etwa 50 Basenpaare lang sind - normale Extraktionsmethoden versagen hier.
Die Gruppe des Tübinger Paläobiologen Hernán A. Burbano hat sich 150 Jahre altes Pflanzenmaterial aus einem Herbarium besorgt und die DNA-Extraktion aus den Proben optimiert (BioTechniques).
Zwar gibt es robuste Protokolle zur Isolierung tierischer aDNA. Diese würden bei Pflanzengewebe jedoch wenig bringen, da grüne Spezies für die rabiate Konfrontation mit EDTA und Proteinase K nicht geschaffen sind.
Die Forscher verglichen daher zunächst zwei gängige, auf „normale, frische Pflanzen“ zugeschnittene Extraktionspuffer. Der erste enthielt das Detergenz CTAB, das in Gegenwart hoher Salzkonzentrationen störende Polysaccharide abfangen soll. Im zweiten war ein Gemisch aus N-Phenacylthiazolbromid (PTB) und Dithiothreitol (DTT) enthalten. PTB spaltet Glukose-basierende Protein-Verflechtungen (Crosslinks) und befreit die DNA aus den zuckersüß verpackten Komplexen. DTT löst als Reduktionsmittel Thiol-modifizierte DNA aus klumpigen Molekülaggregaten heraus.
Und wie fischt man die DNA aus der Extraktionssuppe heraus? Normale DNA würde man einfach mit Ethanol fällen. Bei aDNA ginge hier aber, aufgrund ihrer kurzen Fragmente, einiges durch die Lappen. Deshalb reinigte die Gruppe die Extrakte mihilfe von Silica-Säulchen.
Enthielt der Extraktionspuffer PTB/DTT statt CTAB, so waren die gewonnen Fragmente etwa 35 Prozent kürzer (die Länge lag bei etwa 50 bp). Aber hieß das nun, dass die PTB/DTT-Extraktion tatsächlich kürzere Fragmente isolierte oder dass die aDNA während der Extraktion ungewollt zerstückelt wurde?
Tatsächlich war ersteres der Fall: Cytosin-zu-Thymin-Substitutionen, ein typisches „Schadensmuster“ alter DNA, kamen in den Proben nämlich gehäuft vor. Diese stammen aus spontanen Deaminations-Reaktionen von Cytosin zu Uracil, die in natürlich alterndem Gewebe auftreten. Bei der dsDNA-Bibliothek-Herstellung baut die Polymerase also Adenin anstelle von Guanin in den neuen Strang ein. Der dient als Vorlage, die aDNA-typische Deamination äußert sich nach der Sequenzierung als C-zu-T-Substitution.
Die besten Extraktionsergebnisse lieferten Qiagens MinElute-Säulchen in Kombination mit einem für tierische aDNA entwickelten Puffer. Die sequenzierten Fragmente waren hier circa 10 Prozent kürzer als bei dem ebenfalls getesteten DNAeasy-Kit. Und auch die Korrelation mit dem Gehalt an C-zu-T-Substitutionen stimmte.
Mit dem optimierten aDNA-Extraktionsverfahren stellten die Forscher sowohl Einzelstrang-(ss)DNA-Bibliotheken als auch Doppelstrang-(ds)DNA-Bibliotheken her. In den dsDNA-Bibliotheken beobachteten sie die übliche (verfahrensbedingte) Dominanz von DNA-Fragmenten mit hohem GC-Gehalt. In den ssDNA-Bibliotheken trat diese Schieflage jedoch nicht auf, GC-reiche und GC-arme Fragmente waren gleichmäßig verteilt. Erzeugt man mit dem Protokoll ssDNA-Bibliotheken, so lässt sich der bei dsDNA-Bibliotheken übliche GC-Bias also vermeiden.
Das Tübinger Verfahren zur Extraktion und Sequenzierung alter Pflanzen-DNA ist zumindest für Proben aus Arabidopsis thaliana bestens geeignet. Ob es auch bei anderen problematischeren Arten, etwa mit hohem Lignin- und Polyphenolgehalt funktioniert, müsste man ausprobieren.
Andrea Pitzschke